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PCR實驗步驟說明
PCR實驗室又叫基因擴增實驗室。PCR是聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學(xué)技術(shù),用于放大特定的DNA片段,可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng),能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量,其高達納米級別。
PCR實驗樣本采集、存放及運輸:
1、樣本采集:各類型樣本按照常規(guī)方法采集;
2、存放:樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過72h,-70℃以下可長期保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融(zui多凍融3次);
3、運輸:采用泡沫箱加冰密封進行運輸。
PCR實驗步驟:
1. 產(chǎn)品僅用于科研取凍存已裂解的細胞,室溫放置5分鐘使其完全溶解。
2. 兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang,蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后,15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相,中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
3. RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后15到30℃孵育10分鐘后,于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
4. RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混勻后,4℃下7000rpm離心5分鐘。
5. RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA時,先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次,使其完全溶解,獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,測定RNA溶液 濃度和純度。