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提高PCR特異性熱啟動方法闡述
日期：2024-12-27 11:17
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摘要： 熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產生非特異性的產物。這些非特異性產物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構建和操作，熱啟動PCR尤為有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應液，并將其置于預熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，...
熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產生非特異性的產物。這些非特異性產物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構建和操作，熱啟動PCR尤為有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應液，并將其置于預熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產物的擴增。
熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶在內的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其是對高通量應用。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應用。
Platinum DNA聚合酶對于自動熱啟動PCR來說方便高效。Platinum Taq DNA聚合酶的成分為復合有抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體的重組Taq DNA聚合酶?？贵w在PCR配制，以至于在室溫的延時保溫過程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在變性步驟的94℃保溫過程中被釋放到反應中，恢復了完全的聚合酶活性。同經化學修飾用于熱啟動的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延時保溫（10到15分鐘）以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在94℃進行2分鐘就可以恢復90％的Taq DNA聚合酶活性。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應液，并將其置于預熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產物的擴增。
熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶在內的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其是對高通量應用。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應用。
Platinum DNA聚合酶對于自動熱啟動PCR來說方便高效。Platinum Taq DNA聚合酶的成分為復合有抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體的重組Taq DNA聚合酶?？贵w在PCR配制，以至于在室溫的延時保溫過程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在變性步驟的94℃保溫過程中被釋放到反應中，恢復了完全的聚合酶活性。同經化學修飾用于熱啟動的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延時保溫（10到15分鐘）以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在94℃進行2分鐘就可以恢復90％的Taq DNA聚合酶活性。