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PCR反應(yīng)主要要素引物分析
日期：2024-12-27 17:45
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摘要：
參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2。
引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：
1、引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
2、引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
3、引物堿基：G C含量以40-60%為宜，G C太少擴(kuò)增效果不佳，G C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC...
參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2。
引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：
1、引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
2、引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
3、引物堿基：G C含量以40-60%為宜，G C太少擴(kuò)增效果不佳，G C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
4、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
5、引物3'端的堿基，特別是末及倒數(shù)第2個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。
6、引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
7、引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。