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細(xì)胞周期的測(cè)定步驟
細(xì)胞周期指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個(gè)周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法,但它不能代表細(xì)胞群體的周期,故現(xiàn)多采用其他方法測(cè)群體周期。測(cè)定細(xì)胞周期的方法很多,有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法等,這里介紹一種利用BrdU滲入測(cè)定細(xì)胞周期的方法。
操作步驟:
1、細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)期時(shí),向培養(yǎng)液中加入BrdU,使終濃度為10μg/ml。
2、44小時(shí)加秋水仙素,使每ml中含0.1μg。
3、48小時(shí)后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中,注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。
4、常規(guī)染色體制片(見第三部分:染色體技術(shù))。
5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上,鋪上2×SSC 液,距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
6、棄去2×SSC液,流水沖洗。
7、Giemsa液染色10分鐘,流水沖洗,晾干。
8、鏡檢100個(gè)分裂相,計(jì)、二、三、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。
9、計(jì)算: 細(xì)胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小時(shí))
附:(1)BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。
(2)2×SSC配制: NaCl 1.75克,檸檬酸三鈉?2H2O 0.88克,加水至100ml,4℃保存。